微生态资讯
您现在的位置：金百合生物官网 > 微生态资讯 > 行业资讯 >
双歧杆菌等厌氧菌的分离、培养及活菌计数
作者：金百合小编 2019-08-02
1、目的要求
（1）学习厌氧菌的分离、培养及活菌计数的一般方法。
（2）观察双歧杆菌的形态特征。
（3）了解双歧杆菌的生长特性。
2、基本原理
厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，其生理作用日益受到人们的重视。双歧杆菌是专性厌氧菌，对氧气非常敏感。因此，双歧杆菌的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。
双歧杆菌的最适生长温度37℃～41℃，最低生长温度25℃～28℃，最高43℃～45℃。初始最适pH 6.5～7.0，在pH 4.5～5.0或pH 8.0～8.5不生长。其细胞呈现多样形态，有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、球形、长杆弯曲形、分枝或分叉形、棍棒状或匙形。单个或链状、V形、栅栏状排列，或聚集成星状。革兰氏阳性，不抗酸，不形成芽孢，不运动。双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地。双歧杆菌是人体内的正常生理性细菌，定殖于肠道内，是肠道的优势菌群，占婴儿消化道菌丛的92%。该菌与人体终生相伴，其数量的多少与人体健康密切相关，是目前公认的一类对机体健康有促进作用的代表性有益菌。该菌可以在肠粘膜表面形成一个生理屏障，从而抵御伤寒沙门杆菌、致泻性大肠杆菌，痢疾致贺氏杆菌等病原菌的侵袭，保持机体肠道内正常的微生态平衡；能激活巨噬细胞的活性，增强机体细胞的免疫力；能合成B族维生素、烟酸和叶酸等多种维生素；能控制内毒素血症和防治便秘，预防贫血和佝偻病；可降低亚硝胺等致癌前体的形成，有防癌和抗癌作用；能拮抗自由基、羟自由基及脂质过氧化，具有抗衰老功能。
双歧杆菌的培养方法很多，如厌氧箱法、厌氧袋法、厌氧罐法。这些方法都需要特定的除氧措施，步骤多，较繁琐。本实验介绍的是一种简便的试管培养法——亨盖特厌氧滚管技术。亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术，以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趋完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一套完整技术，而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。该技术的优点是：预还原培养基制好后，可随时取用进行试验；任何时间观察或检查试管内的菌都不会干扰厌氧条件。
3、实验材料
氮气、厌氧管、注射器、培养箱、冰块、水浴锅、镊子、记号笔、双歧酸奶、PTYG培养基、酒精棉球、瓷盘、振荡器、铜柱除氧系统、定量加样器等。
4、实验方法与步骤
4．1 铜柱系统除氧
铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。此管的大小为40～400mm，两端被加工成漏斗状，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，另一端连接出气管口。由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2 、和H2等都含有微量O2，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。此铜柱可以反复的使用，并不断起到除氧的目的。当然H2源也可以由氢气发生器产生。
4．2 预还原培养基及稀释液的制备
制作预还原培养基及稀释液时，先将配置好的培养基和稀释液煮沸驱氧，而后用定量加样器趁热分装到螺口厌氧试管中，一般琼脂培养基装4.5～5.0mL，稀释液装9mL，并插入通N2气的长针头以排除O2。此时可以清楚的看到培养基内加入的氧化还原指示剂—刃天青由蓝到红最后变成无色，说明试管内已成为无氧状态，然后盖上螺口的丁烯胶塞及螺盖，灭菌备用。
4．3 分离
（1）编号 取五支无菌水试管，分别用记号笔标明10-1、10-2～10-5。
（2）稀释 在无菌条件下，用无菌注射器吸取1mL混合均匀的液体样品，加入装有预还原生理盐水的厌氧试管中，用震荡器将其混合均匀，制成10-1稀释液。用无菌注射器吸取1mL 10-1稀释液至另一装有9mL生理盐水的厌氧试管中，制成10-2稀释液。依此进行10倍系列稀释，至10-7，制成不同样品稀释液。通常选10-5、10-6、10-7三个稀释度进行滚管计数。
（3）滚管 将无氧无菌的琼脂培养基在沸水浴中溶化，置46～50℃恒温的水浴中待用，用无菌注射器吸取10-5、10-6、10-7三个稀释度各0.1mL，分别注入待用的试管中，然后将其平放于盛有冰水的瓷盘中迅速滚动，带菌的溶化琼脂在试管内壁会即刻形成凝固层。
（4）分离 生成的菌落需挑取出来，镜检其形态及纯度。如尚未获得纯培养物，需再次稀释滚管，并再次挑取菌落，直至获得纯培养物为止。待挑取的单菌落预先在放大镜下观察确定，做好标记。然后将培养基试管固定于适当的支架上，打开试管胶塞，同时迅速将气流适当、火焰灭过菌的氮气长针头插入管内。同时，另一液体厌氧管去掉胶塞插入另一灭过菌的通气针头。将准备好的弯头毛细管小心插入固体培养基内，找准待挑菌落，轻轻吸取，转移至液体试管内，加塞。37℃培养。培养24h或待培养液混浊后检查已分离培养物的纯度。
4．4 计数
液体纯培养物经系列稀释后，按上述滚管法培养。然后对固体滚管计数，计算每克或每毫升样品中含有的双歧杆菌数量。公式如下：
双歧杆菌数量cfu/g（mL）样品=0.1mL滚管计数的实际平均值×10×稀释倍数
5、注意事项
（1）注射器在使用前必须经过121℃、20min灭菌。
（2）注意无菌操作，保持手和培养管的清洁。每次接种前需用酒精棉球将厌氧管盖子擦一遍。
（3）用注射器吸取菌悬液注入固体培养基后，如需再次吸取，应快速将注射器插入厌氧管中，以防止针头污染。
文章来源于微生物技术应用，版权归原作者所有
上一篇：发酵饲料的生产与应用技术研究 下一篇：40种常见饲料原料基础知识（1-10）
